Introducción

Landois en el siglo pasado fue el primero en descubrir variaciones en la sangre perteneciente a diferentes especies, cuando vio que al mezclar sangre humana con sangre de animales superiores, se producía aglutinación o lisis de los eritrocitos. La posibilidad que existieran diferencias similares dentro de la misma especie fue establecida posteriormente por Landsteiner en 1901, al descubrir los grupos A, B y O en la sangre humana.

Los estudios de grupos sanguíneos en animales se inician alrededor de 1900, cuando se demostraron diferencias individuales en sangre caprina. Lehnert en 1939 fue el primero en investigar los grupos sanguíneos del equino utilizando para ello sueros hiperinmunes. Sin embargo, fueron Stormont, Suzuki y Rhode en 1964, quienes impulsaron su estudio al descubrir 16 grupos sanguíneos y determinar a su vez su forma de transmisión.

Por otra parte, la aplicación del polimorfismo proteico fue posible gracias a las diferentes formas de electroforesis, especialmente al uso de almidón como soporte introducido por Smithies en 1955.

Grupos sanguíneos

Los eritrocitos tienen su membrana tapizada de determinantes antigénicos que pueden ser propios o adquiridos. A excepción del caso de los antígenos M – L de los eritrocitos ovinos, que han sido asociados con la bomba de potasio de la membrana, a estos antígenos no se les conoce una función determinada. La mayoría de ellos son carbohidratos o proteínas y parecen ser componentes de la membrana celular. Hacen excepción a esto, los antígenos adquiridos, que aunque se encuentran en los eritrocitos, su síntesis ocurre en otros sitios del organismo. Este tipo de antígenos se encuentran libres en suero, saliva y otros fluidos orgánicos y son absorbidos pasivamente a la superficie del eritrocito. Ejemplos de estos antígenos son el J de los bovinos, R de los ovinos, el A y O de cerdo y el Tr del canino.

Los antígenos de superficie de los eritrocitos se llaman también antígenos de grupos sanguíneos. Algunos de ellos son genéticamente fijos, es decir ocurren en los eritrocitos de todos los miembros de una misma especie, otros son genéticamente variables, es decir ocurren en los eritrocitos de algunos miembros de una especie. En este último grupo está representado el sistema A B O de los grupos sanguíneos humanos.

La expresión de los antígenos de grupos sanguíneos está controlada por genes y son heredados en forma convencional. Si alguno se hereda en conjunto de dos o más, se les conoce como fenogrupo. Los alelos o fenogrupos controlan á su vez un número variable de factores antigénicos eritrocitarios.

Además de poseer antígenos de grupos sanguíneos en sus células, los animales también poseen anticuerpos séricos contra otros grupos sanguíneos y se llaman isoanticuerpos. Fueron estos anticuerpos los que se usaron para determinar diferencias sanguíneas en los trabajos iniciales.

Se piensa que estos isoanticuerpos naturales derivan no de un contacto anterior con eritrocitos foráneos, sino como consecuencia de una exposición a determinantes antigénicos similares o idénticos que comúnmente ocurren en la naturaleza (antígenos heterófilos). Muchos antígenos de grupos sanguíneos por ejemplo, son componentes estructurales comunes de gran variedad de organismos como plantas, bacterias, protozoos y helmintos.

Los antígenos eritrocitarios en el caballo se desarrollan durante la vida fetal. Se ha demostrado en fetos de 4 a 5 meses de edad, concentraciones de estos antígenos tan altas como en el adulto.

En el equino, se describen 7 sistemas genéticos y cada uno de ellos contienen factores antigénicos en número variable (Ver Tabla 1). En el caso de los sistemas A y D, éstos son los denominados fenogrupos. Cabe hacer notar que estos sistemas están en constante estudio y el número de factores va variando a medida que se descubren nuevos antígenos.

Tabla 1 Grupos sanguíneos del equino. Gentileza Dr. K. Bell 1985.

Sistemas Grupos Sanguíneos

Factores

Alelos

A

Aa, Ab, Ac, Ad, Ae, Af, Ag

Aa, Aadf, Aadg, Ab, Abc, A bce, Ac, Acd, Ace, Ae, A-

C

Ca

Ca, C-

D

Da, Db, Dc, Dd, De, Df, Dg, Dh, Di, Dk, DI, Dm, Dn, Do

adl, D adln, D bcm, D cgm, D cefgm, D cegimn, D del , D delo, D dln, D dfki, D dkl   ,D dghm, D-

K

Ka

Ka, K-

P

Pa, Pb, Pc

Pa, Pac, Pb, P-

Q

Qa, Qb, Qc

Q abc, Q ac, Qb, Qc, Q-

U

Ua

Ua, U-

La determinación de los grupos sanguíneos se realiza por medio de pruebas de aglutinación y lisis de los eritrocitos del equino problema. Para ello se utilizan antisueros obtenidos por hiperinmunización de caballos y conejos, y además para la prueba de lisis se necesita también suero de conejo previamente absorbido con eritrocitos de equino, como complemento.

Polimorfismo de proteínas

Polimorfismo significa, a grandes rasgos, variación controlada genéticamente.

Muchas, si no todas las proteínas y enzimas se presentan en formas variantes. Esto se ha ido demostrando a medida que las técnicas han ido mejorando, y especialmente desde la aplicación de la electroforesis en gel de almidón. Con este método, se agrega un efecto tamiz del gel al resto de los factores que influencian la separación proteica. Diferencias en migración electroforética no sólo ocurren entre diferentes tipos de proteínas, sino también dentro de un mismo tipo. Estas diferencias de migración pueden deberse a diferencias en su estructura aminoacídica. Puede haber variación de un aminoácido como también de cadenas completas de ellos. Las diferencias dentro de un tipo de proteína refleja diferencias causadas por mutaciones en el código genético. En la Tabla 2 se entregan algunos sistemas electroforéticos usados en el caballo.

Tabla 2 Sistemas electroforéticos. Gentileza Dr. K. Bell 1985.

Sistema

Locus

Alelos

Albúmina

Al

A, B

Fosfatasa ácida

AP

F, S

Anhidrasa carbónica

CA

F, I, L, O, S

Catalasa

Cat

F, S

NADH diaforasa

Dia

F, S

Esterasa

Es

F, G, H, I, S

Peptidasa A

Pep A

F, S

Prot. ligante Vit. D

Gc

F, S

Hemoglobina

Hb

A, BI, BII

Postalbúmina

Xk

F, K, S

6-fosfogluconato dehidrogenasa

PGD

D, F, S

Fosfoglucomutasa

PGM

F, S, V

Fosfohexosa isomerasa

PHI

F,1, S

Inhibidor Proteasa

Pi

F, G, I, L, N, P, Q, R, S1 S2 T, U, V, W, Z

Transferrina

Tf

D, F1, F2, H, M, O, R

En la electroforesis en gel de almidón teñido, la variación proteica aparece como bandas teñidas que han migrado a diferente velocidad y han quedado a diferentes distancias del punto de origen. A modo de ejemplo, en el caballo la albúmina tiene 2 alelos que controlan su herencia. El alelo AIA codifica para una molécula que se mueve ligeramente más rápido a través del gel, que la codificada por el alelo AIB. Un animal recibe un alelo en cada locus de cada uno de sus progenitores. Por lo tanto un individuo puede tener uno de los tres tipos de albúmina posibles: AA, AB, o BB (ver Figura 1). Obviamente, en sistemas con más alelos habrá mayor número de combinaciones posibles.

Figura 1. Polimorfismo de Albúmina. Gentileza J. Groenewald, 1985.

El determinismo genético de las proteínas sanguíneas sigue las reglas Mendelianas simples y son estables durante toda la vida.

En el caballo, la ontogénesis de los constituyentes séricos difieren según el sistema del cual se trate. En el feto la anhidrasa carbónica está presente sólo en su forma fetal, la transferrina presenta ausencia de ciertas bandas o éstas se presentan en forma muy débil, y la esterasa empieza a aparecer a los 10 meses de desarrollo. En las primeras semanas de vida algunas enzimas no tienen la misma actividad que en el adulto y además existen casos como el de la hemoglobina en que aún existe tipo fetal. A diferencia de las anteriores, la albúmina, la catalasa y la 6 fosfogluconato dehidrogenasa son iguales para el feto como para el equino adulto.

Tipificación sanguínea

Los grupos sanguíneos y las proteínas sanguíneas polimórficas son marcadores genéticos que, por prestarse perfectamente para la identificación de un animal, se ocupan en conjunto con el nombre de tipificación sanguínea.

La eficiencia de cada sistema genético para el control de origen, depende del número de alelos, de su frecuencia en la población en estudio y de la relación entre genotipo y fenotipo, es decir de la posibilidad de determinación directa del genotipo por el fenotipo.

Los diferentes sistemas genéticos no tienen el mismo poder de discriminación para identificar un animal y verificar su filiación. Es por esto que se usa una combinación de ellos y mientras mayor número de sistemas se utilizan mayor será la seguridad del resultado.

Aplicación de la tipificación sanguínea

1. Identificación del individuo

El equino nace con un tipo sanguíneo que no puede ser alterado en ninguna forma. De este modo, una vez que este tipo sanguíneo ha sido determinado, el animal puede ser identificado positivamente a través del análisis de una muestra de sangre durante toda su vida y todas las veces que se estime conveniente.

Se calcula que el número de tipos sanguíneos distintos en el equino sobrepasa el billón. Es por esto que la posibilidad que dos caballos seleccionados al azar tengan el mismo tipo de sangre es tan remota que puede considerarse imposible, a no ser que se trate de gemelos idénticos.

Por lo anterior, se considera que el tipo sanguíneo de un equino puede compararse a la huella digital del hombre, y cuando se utiliza junto con los datos del animal como sexo, color, edad y marcas naturales o adquiridas, se logra una identificación completa.

2. Verificación de paternidad dudosa

Las características genéticas o sistemas utilizados para resolver problemas de paternidad dudosa deben cumplir con ciertos requisitos:

a) Dichas características deben ser de herencia simple y directa, o sea, esto implica que deben ser dominantes. b) La base genética para la herencia debe ser conocida perfectamente. c) Deben aparecer al nacimiento o corto tiempo después. d) Deben ser características estables a través de la vida del individuo y no ser influenciables por cambios en el medio ambiente. e) Deben ser detectadas por medio de pruebas confiables y objetivas.

Todos los casos de investigación de parentesco, se basan en el principio de exclusión genética, es decir, establecer que cierto animal no puede ser padre o madre del potrillo en cuestión. Un caballo se califica como padre o madre de un producto si posee los factores genéticos determinantes que lo acrediten como tal.

La verificación se realiza en casos específicos, cuando por alguna razón surgiera la duda sobre la paternidad de un determinado producto, como por ejemplo:

a) Cuando la filiación del animal no corresponde a la que se realizó cuando potrillo. b) El color del potrillo sea genéticamente incompatible con el de sus supuestos padres. c) Se sospecha de algún cambio de animales, ya sea accidental o premeditado. d) La conformación o marcas poco usuales de un producto hace surgir dudas respecto a sus padres. e) Un comprador quiere proteger su inversión comprobando el pedigree del caballo que adquirió. f) El propietario de una yegua enviada a servir por un semental de otro criadero, quiere confirmar que el potrillo es efectivamente hijo del semental contratado.

g) Se utilizaron dos sementales distintos para cubrir una misma yegua.

Con respecto a este último punto, Bowling (1985) investigó la certeza de asignar la paternidad al segundo potro, en potrillos cuyas madres fueron servidas por dos potros diferentes con un intervalo entre 1 y 45 días. De 106 casos se determinó que un 5,5% de ellos, el producto resultante correspondía al primer potro, por lo que el dato de monta no es confiable como fuente única de asignación de paternidad.

Con respecto al número de sistemas genéticos para verificar paternidad, Grosclaude (1980) demuestra la utilidad de usar un número adecuado de sistemas, la participación de cada uno en el porcentaje de exclusión, el resultado de utilizar grupos sanguíneos y proteínas polimórficas por separado, y la potenciación del resultado al usarlos en forma integrada (Tabla 3).

Tabla 3 Porcentajes de exclusión en casos de paternidad dudosa en caballos fina sangre franceses. F. Grosclaude 1980.

Sistemas

% exclusión por sistema

% exclusión por grupo de sistemas

Total

A C D K P Q U

8,1 0 64,0 1,4 5,8 5,8 5,3

►72.6

►---- 88,5

Al Tf Es

14,1 39.9 4,1

►50,5

6-PGD PGM PHI

12,5 0,6 2,5

► 15,1

Para realizar una verificación de paternidad se necesita una muestra de sangre con citrato como anticoagulante, del potrillo, de la madre y de los potros utilizados. Dichas muestras se envían al laboratorio donde son procesadas y se obtienen los tipos sanguíneos de todos los animales. Para realizar el análisis de los datos, se buscan aquellos factores presentes en el potrilla y que están ausentes en la madre y, por lo tanto, obligatoriamente deben de provenir del padre. Aquel potro que no los posea queda automáticamente excluido.

El ejemplo de la Tabla 4, resume lo anteriormente expuesto. En dicho ejemplo los potros Storik, Raktha y Masrick quedan excluidos como posibles padres, mientras que Azymdar califica como padre según las aglutininas J y 4 y según los sistemas de transferrinas y de anhidrasa carbónica.

Tabla 4 Caso de Paternidad dudosa. D. R. Osterhoff, 1974

ANIMAL

HEMOLISIS

AGLUTININAS

PROTEINAS

Potro

A

C

5

7

8

14

17

22

25

J

K

1

2

4

5

Hb

Tf

Alb

Ca

Es

Storik

+

+

+

+

+

-

+

+

+

-

-

+

-

-

+

AA

DH

AB

IS

FI

Raktha

+

+

+

-

+

-

-

-

-

-

-

+

-

-

-

AA

DO

AB

IS

FF

Masrik

+

+

+

-

+

-

+

+

-

-

-

+

-

-

+

AA

DH

AB

IS

II

Azymdar

+

+

+

-

+

-

-

-

-

+

-

+

-

+

-

AA

FF

BB

FS

II

Yegua Sally

+

+

-

+

+

+

+

-

-

-

+

+

+

-

-

AA

HH

BB

SS

FF

Potrillo

+

+

+

+

+

+

- -

+

+

+

+

+

-

AA

FH

BB

FS

FI

3. Prevención de la enfermedad hemolítica del recién nacido

La base de esta incompatibilidad sanguínea del equino que depende principalmente de una diferencia de genes se ilustra en la Figura 2.

El potrillo hereda de su padre la habilidad para producir un determinado factor eritrocitario que está ausente en su madre, el cual actúa como un antígeno cuando por cualquier motivo alcanza la circulación materna. La yegua a su vez, elabora anticuerpos capaces de reaccionar específicamente con este factor eritrocitario. Generalmente, en las primeras tres preñeces los anticuerpos en el caso de estar presentes, lo están en concentraciones muy bajas para causar un daño apreciable. A diferencia del humano, estos anticuerpos no Ilegan al feto debido al tipo de placenta de la yegua, sino que se concentran en el calostro y pasan al potrillo en el momento de mamar. En preñeces posteriores, sin embargo, los anticuerpos calostrales pueden aumentar en concentración y van a reaccionar con el antígeno eritrocitario del potrillo produciéndole una destrucción de sus glóbulos rojos, que pueden llegar a causarle la muerte.

Setenta y ocho por ciento de las veces el primer potrillo afectado ocurre entre el cuarto y el séptimo parto. Casos ocurridos en las primeras preñeces son escasos, pero siempre existe la posibilidad de que la hembra se haya sensibilizado en una preñez anterior que terminó en aborto o bien a través de una transfusión sanguínea. Los factores eritrocitarios que más comúnmente producen un cuadro de isosensibilización son: A y Q.

El potrillo generalmente nace sano, pero desarrolla un síndrome hemolítico después de tomar calostro hasta varios días de nacido. Los animales afectados muestran signos que varían en intensidad, típicos de una anemia de tipo hemolítica como ser: debilidad, hemoglobinuria, mucosas pálidas que se vuelven ictéricas. La severidad de la enfermedad depende de:

a) Concentración de anticuerpos en el suero y calostro de la hembra. c) Concentración de anticuerpos que llegan al suero del potrillo. Esto dependerá de la cantidad de calostro que tome y la capacidad de absorción del tracto digestivo. d) Naturaleza de la reacción antígeno-anticuerpo.

Los animales severamente afectados generalmente mueren a las 24 horas pero esto puede prolongarse hasta 2 a 6 días de nacido.

El tratamiento del animal afectado consiste en una transfusión sanguínea. En caso que no se contara con un donante compatible, se puede usar eritrocitos lavados provenientes de la madre.

Como prevención, se recomienda no cruzar animales con los grupos sanguíneos incompatibles mencionados. Otra posibilidad sería realizar la prueba de compatibilidad mezclando suero de la yegua con eritrocitos del potro antes del parto, para detectar ahí la incompatibilidad. Si la hubiera, se recomienda que la hembra tenga su parto bajo vigilancia y al potrillo se le impida mamar de su madre, y se le dé calostro de otra yegua. A la yegua se le debe ordeñar el calostro y posteriormente a las 36 horas de nacido, el potrillo podrá mamar en pequeñas cantidades bajo supervisión para detectar reacciones adversas.

4. Selección de Donantes de Sangre

El uso de una transfusión sanguínea no es común en la práctica equina, sin embargo, con el avance de las técnicas quirúrgicas y de diagnóstico, muchas veces llega a ser la única forma de salvar la vida del animal. Al realizarla con cuidado y con la ayuda de la tipificación sanguínea los riesgos son mínimos.

Los sistemas A y Q son altamente antigénicos y producen títulos hemolíticos sobre 1 : 8 generalmente en un período de una semana. Para prevenir reacciones adversas en transfusiones y la posibilidad de sensibilizar yeguas de cría que carezcan de estos antígenos, se recomienda usar donantes que tampoco tengan estos factores. Esto es bastante difícil ya que tanto en la raza árabe como en la fina sangre inglés existe una gran predominancia especialmente del factor A. Muchas veces es necesario usar donantes de otras razas en los cuales los factores en cuestión están presentes en menor proporción.

5. Estudio de poblaciones

El caballo tiene fósiles de hasta 75 millones de años. La domesticación y la intervención humana concomitante en el sistema de cruzas han influenciado la evolución de una serie de razas con variados propósitos. Con la apertura de los Stud Books y la definición de las características de cada raza, es importante conocer los marcadores sanguíneos presentes y la variación de éstos en los grupos de cría.

Variados autores se han preocupado de comparar los factores en las diferentes razas equinas para ser utilizados en casos de verificación de parentesco. Es importante hacer notar que la frecuencia de aparición de algunos factores varía en las diferentes razas, por lo que la utilidad de estos factores para estos usos también varía.

Trommershausen-Bowling y Clark (1985) determinaron que para siete razas equinas americanas, los sistemas más efectivos fueron el sistema D de los grupos sanguíneos, las transferrinas y el Inhibidor de Proteasa. En las 7 razas estos tres sistemas tenían un porcentaje de exclusión entre 86 a 98%.

La tipificación sanguínea no es un tema estático. Continuamente se están estudiando nuevos marcadores, nuevas técnicas y nuevas formas de aplicación.

Dado que en nuestro país es algo relativamente nuevo, son muchas las proyecciones que se le puede dar, no solamente en la especie equina, sino también en otras especies animales.

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