Monografías

  • Capacitación espermática y reacción acrosómica in vitro en bovinos

Resumen

Abstract

Introducción

Entre los eventos claves que regulan la fecundación, están la capacitación espermática y la reacción del acrosoma. Los espermatozoides recién eyaculados no son capaces de fecundar al ovocito, ellos deben permanecer por un cierto período de tiempo en el tracto reproductivo femenino para adquirir la capacidad fecundante, fenómeno que se ha denominado capacitación espermática, (Austin, 1951; Chang, 1951), este período es variable en las diferentes especies y en los bovinos se ha descrito que duraría aproximadamente 4 horas (Morrow, 1986). Se ha definido a la capacitación como los cambios que preparan al espermatozoide para la hiperactivación y reacción acrosómica. Esta última es un prerequisito para la penetración de la zona pelúcida y para la fusión del espermatozoide con la membrana plasmática del ovocito, constituyendo un mecanismo de control para la fecundación (Barros y Berríos,1977; Yanagimachi,1988; Fraser, 1992).

Entre los cambios que ocurren durante la capacitación, previo a la hiperactivación y reacción acrosómica, se encuentran, los siguientes: alteración de las glicoproteínas de la superficie del espermatozoide, modificaciones de las proteínas y lípidos de la membrana plasmática al calcio y activación del sistema adenilato ciclasa (Yanagimachi, 1989.; Fraser, 1990).

La reacción acrosómica se puede considerar como una exocitosis en que las membranas plasmáticas y acrosómica externa se fenestran y se fusionan progresivamente entre sí (Bedford y Cooper, 1978; Roldan y Harrison, 1990), permitiendo que el espermatozoide establezca una unión secundaria con la zona pelúcida, iniciando así su paso a través de ella para más tarde fusionarse con la membrana plasmática del ovocito (Barros y Berríos, 1977).

Las evidencias indican que para que estos cambios ocurran es necesario el calcio extracelular, al menos parte del que es internalizado (Fleming y Yanagimachi,1984; Langlais y Roberts, 1985). No obstante, aun no está completamente claro el mecanismo que controla el flujo del calcio; sugiriéndose que ésta podría producirse a través de los canales de calcio operados por receptores, o como el resultado de estímulos extracelulares y mecanismos de regulación iónica (Roldán y Harrison,1990), donde estaría involucrada la proteína G (Kopt, 1990). Se sabe que el aumento de este ión intracelularmente, provoca variadas respuestas, entre ellas la estimulación de la adenilato ciclasa, lo que a su vez induce un aumento en el AMPc y activación de fosfolipasas asociadas a la membrana, con la consiguiente perturbación de la membrana plasmática (Fraser, 1990).

Tratamiento in vitro

Imitar in vitro estos fenómenos que ocurren naturalmente en el tracto reproductivo femenino, es de gran interés y representa un desafío importante en los estudios de fecundación; es por ello que para lograr este propósito, se han desarrollado diversas técnicas en las diferentes especies, utilizando variados regímenes de incubación.

En espermatozoides de toro ha sido posible inducir la capacitación espermática y reacción acrosómica mediante diferentes tratamientos, tales como: preincubaciones en el útero (Hanada y Nagase, 1981), utilización de soluciones de alta fuerza iónica (Brackett y col.,1982), cultivos con ionóforo de calcio 23187 (Bird y col—1989), coincubaciones con células epiteliales de oviductos de vacas (Ellington y col.,1991) y glicosaminoglicanos (GAGS) (Lenz y col., 1983; Parrish y col., 1985; Ax y Lenz, 1987; Uguz y col., 1992).

Glicosaminoglicanos (GAGS)

La presencia de GAGS en el tracto reproductivo de la vaca, como en otras especies, ha sugerido que estos pueden cumplir un rol fisiológico en la preparación espermática para la fecundación in vivo.

En la vaca las concentraciones totales de GAGS decrecen significativamente de 34 a 20 a 9 mg/100 mg de proteína en el cervix, caemos uterinos y oviductos respectivamente (Lee y Ax, 1984). Es posible que esta gradiente de concentración en el tracto genital de la hembra sirva para optimizar la localización de la capacitación espermática. También se ha visto que la concentración de GAGS en el mucus cervical durante la época estral es mayor que aquella de la fase luteal, (Ax y Lenz, 1987). Otras fuentes de GAGS que los espermatozoides bovinos pueden encontraren el tracto reproductivo femenino, son el ácido hialurónico secretado por las células del cúmulo que rodean al ovocito y los GAGS del líquido folicular.

De acuerdo a esto en los últimos años se han empezado a utilizarlos GAGS, especialmente la heparina, para capacitar espermatozoides bovinos en las prácticas de fecundación in vitro (Lee y Gordon,1988; Fukui y col., 1989; Gordon y Lee, 1990; De los Reyes y Pérez, 1991; De los Reyes, 1992).

Los GAGS son cadenas lineales de polisacáridos usualmente unidos a un núcleo protéico formando un proteoglicano. Estos son componentes de la matriz extracelular y se encuentran sobre las superficies celulares; también son componentes integrales de las membranas (Ax y Lenz, 1987). Las diferencias químicas entre GAGS, sirven para distinguirlos en diferentes clases. El ácido hialurónico es pobremente sulfatado, mientras que la heparina, heparan sulfato y dermatan sulfato son sobresulfatados (Ax y col., 1985).

Heparina, como agente inductor

Tanto la heparina, como el condroitín sulfato A, B o C  y el ácido hialurónico promueven la reacción acrosómica en espermatozoides bovinos; su acción inductora estaría relacionada al grado de sulfatación de estos compuestos (Handrow y col., 1982), siendo la heparina el GAG con mayor efecto inductor (Parrish y col., 1985; 1986). Esta propiedad sería una acción indirecta que predispondría a los espermatozoides para responder al calcio (Lenz y col., 1982; Parrish y col., 1988), requisito obligatorio para que ocurra la reacción acrosómica (Yanagimachi y Usui, 1974; Langlais y Roberts,1985) y para gatillar los cambios de membrana, típicos de este fenómeno. La heparina se uniría específicamente a los espermatozoides en forma saturable, reversible, dependiente de ph, de temperatura y de la concentración de calcio en el medio, promoviendo la captación de este ión por parte de las células a través de los canales iónicos (Parrish y col., 1988), provocando el incremento de los niveles de AMPc (Uguz y col., 1992). Sin embargo, la localización del receptor de la heparina en el espermatozoide bovino, aún no ha sido bien determinada es posible que estos eventos estén confinados a la región anterior de la cabeza del espermatozoide.

La capacitación espermática en bovinos, dada por la heparina, depende de su concentración en el medio de incubación (Parrish y col., 1985); así, se describen tasas de fecundación in vitro sobre el 70%, utilizando dosis entre 10 µg/ml a 20 µg/ml de heparina (Lee y Gordon, 1988; Parrish y col., 1988). También el tiempo de incubación afectaría la respuesta de los espermatozoides a los tramientos con heparina. La heparina se uniría a los espermatozoides bovinos alcanzando la saturación a las 2 horas (Handrow y col., 1984); sin embargo, la capacidad fecundante de éstos se empieza a expresar después de las 2,5 horas, manifestándose plenamente cuando los espermatozoides son incubados por 4 horas (Fig. 1) (Florman y First, 1988a; Parrish y col., 1988; De los Reyes, 1992).

El efecto inductor de la capacitación de la heparina, es bloqueado por la presencia de glucosa en el medio; aunque el mecanismo molecular se desconoce, se cree que se estaría alterando el ATP espermático a nivel respiratorio, como también el pH celular (Parrish y col., 1985; 1988; Florman y First, 1988a). Sin embargo, este efecto bloqueador de la glucosa puede revertirse mediante la adición de cafeína o isobutilmetilxantina al medio (First y Parrish,1988). Al respecto, se ha demostrado, que las tasas de fecundación in vitro de ovocitos bovinos, aumentan significativamente cuando se agrega cafeína al medio de incubación con heparina (Niwa y Ohgoda, 1988), sugiriéndose un efecto sinérgico entre ambas sustancias.

  TIEMPO DE INCUBACIÓN Y PORCENTAJE DE PENETRACIÓN

FIGURA N° 1: PORCENTAJES DE PENETRACIÓN ESPERMÁTICA EN OVOCITOS DE VACA Y ZONAS PELÚCIDAS BOVINAS, SEGÚN TIEMPO DE INCUBACIÓN DE LOS ESPERMATOZOIDES EN MEDIO DE CULTIVO CON HEPARINA (DE LOS REYES, 1992)

Por otra parte, aunque la capacitación espermática y la reacción acrosómica pueden ocurrir en forma espontánea e independiente de la presencia del huevo; no obstante, se ha probado que las envolturas ovocitarias cumplirían un rol importante en este proceso. Ciertas evidencias experimentales estarían demostrando que la reacción acrosómica podría considerarse como una respuesta ante un agonista derivado del ovocito o de sus cubiertas más cercanas, esto probablemente gatillaría el influjo de calcio a través de los canales operados por receptores específicos (Kopt,1990; Roldan y Harrison,1990). En el ratón se ha postulado que el componente protéico del agonista espermático de la zona pelúcida, ZP3, estaría asociado a la actividad inductora de la reacción acrosómica (Florman y col., 1984; Florman y Wassarman, 1985; Saling y col., 1990). Esta propiedad de la zona pelúcida de inducir la reacción acrosómica, se ha descrito en hamster (Cherr y col.,1986; Uto y col., 1988), conejo (O'Rand y Fisher, 1987) y humanos (Cross y col, 1988). Estudios realizados en espermatozoides de toro y zonas pelúcidas de vaca, han demostrado que en esta especie la reacción acrosómica también sería gatillada por proteínas de la zona, las cuales promoverían un aumento de calcio y pH en el espermatozoide a través de la proteína G (Flormany col.,1990); esta inducción estaría regulada por la capacitación (Florman y First,1988 a) y por componentes del plasma seminal, ya que los espermatozoides epididimarios de toro, no responderían al estímulo de la reacción por parte de la zona pelúcida (Florman y First, 1988 b). De igual forma, se ha indicado que en los bovinos durante la interacción gametica, las células del cúmulo tendrían una acción significativa en la inducción de la reacción acrosómica y promoverían además una alta tasa de fecundación, segmentación y desarrollo de blastocitos In vitro (Fukui, 1990).

En el manejo de los gametos in vitro, se debe considerar que la exocitosis prematura del cromosoma está asociada a una disminución en la capacidad fecundante de los espermatozoides. Es por ello, la importancia de coordinar adecuadamente el momento de la coincubación de los espermatozoides con los ovocitos para lograr índices satisfactorios en los procedimientos de fecundación in vitro.

Bibliografía seleccionada

Austin, C. R. (1951). Observation on the penetration of the sperm into the mammalian egg. Austr. J. Sc. b4: 581–96.

Ax, R.L. & Lenz, R.W. (1987). Glycosaminoglycans as probes to monitor differences in fertility of bulls. J. Dairy Sci. 70:1477–1486.

Barros, C. & Berríos, M. (1977). Is the activates spermatozoon really capacitated? J. Exp. Zool. 201: 65–72.

Bedford, J.M. & Cooper, G.W. (1970). Membrane fusion events in the fertilization o vertebrate eggs. En: Membrane Fusion. Poste, G. & Nicholson, G. L. (eds). Amsterdan: Elsevier. pp. 65–125.

Bird, J.M. Carey, S. & Houghton, J.A. (1989). Motility and acrosomal changes in ionophoretreated bovine spermatozoa and thei relationship with in vitro penetration of zonafree hamster oocytes. Theriogenology 32:227–242.

Brackett, b.g., Cofone, M.A., Boice, M.L. & Bousquett, D. (1982). Use of zonafree hamsterova to assess spermfertilizing ability of bull and stallion. Gamete Res. 5:217–227.

Cross, N.L., Morales, P., Overstreet, J.W.& Hanson, F.W. (1988). Induction of the acrosome reaction by the human zona pellucida. Biol. Reprod. 38: 235–244.

Chang, M. (1951). fertilizing capacity of spermatozoa deposites into the fallopian tubes. Nature 168: 697–698.

Cherr, G.N., Lambert, H., Meizel, S., Katz, D.F. (1986). In vitro studies of the golden hamster sperm acrosome reation: completion on the zona pellucida and induction by homologous soluble zona pellucidae. Dev. Biol.114:119–131.

De los Reyes, M.I. y Perez, C. (1991). Inmunolocalizacion de acrosina durante la capacitación de espermatozoides de toro. Arch. Biol. Men. Exp. 24:147.

De los Reyes, M.I. (1992). Estudio de la cinética de la liberació de acrosina en espermatozoides de toro durante la capacitación, reacción acrsómica y penetración de la zona pelúcida. Tesis Magister. Fac. Medicina U. de Chile.

Ellington, J.E., Padilla, A.W., Vredenburgh, W.L. & Foote, R.H. (1991). Behavior of bull spermatozoa in bovine uterine tube epithelial cell co–culture: and in vitro model for studyng the cell interactions of reproduction. Theriogenology 35: 977–989.

First, N.L. y Parrish, J.J. (1988). Sperm maduration and in vitro fertilization. 11th Intern. Congr. Anim. Reprod. and AJ. dublin Irland 5:160–168.

Fleming, A. & Yanagimachi, R. (1984). Evidence suggesting the importance of fatty acid and the gfatty acid moieties of sperm membrane phospholipids in the cromosome reaction of ginea pig spermatozoa. J. Exp. Zool. 229: 485–489.

Florman, H.M., Bechtol, K.B. & Wassarman, P.M. (1984). Enzymatic dissection of the functions of the mouse egg's receptor for sperm. Dev. Biol. 106: 243–255.

Florman, H.M. & Wassarman, P.M. (1985). O–linked oligosaccharides of mouse egg ZP 3 account for its sperm receptor activity. Cell 41: 313–324.

Florman, H.M. & first, N. (1988a). The regulation of acrosomal exocytosis. I. Sperm capacitation is required for the induction of acrosome reactions by the bovine zona pellucida in vitro. Dev. Biol. 128: 453–463.

Florman, H.M. & First, N. (1988b). The regulation of acrosomal exocytosis. II The zona pellucida–induced acrosome reation of bovine spermatozoa is controlled by extrinsic positive regulatory elements. Dev. Biol.128: 464–473.

Florman, H.M., Babcock, D.F., Bourssa, P.M., Firs, N.L., Kerlin, D.M. y Tombes, M.R. (1990). Egg activated signal teansducing pathways in mammalian sperm: What are they and how are they regulated during development and fertilization?. En: Fertilization in mammals. Serono Symposio, U.S.A. Bavister, B.D. Cummings, J. y Roldan, E.R. (eds), pp 77–88.

Fraser, L. (1990). Sperm capacitation and its maduration. En: Fertilization in mammals. Serono Symposia, U.S.A. Bavister, B.D., Cummins, J. & Roldan, E.R. (eds), pp. 41-153.

Fraser, L. (1992) Requirements for successful mammalian sperm capacitation and fertilization. Arch. Pathol. Lab. Med.116: 345–350.

Fukui, Y., Urakawa, M., Sasaki, C., Chipamatsu, N. & Ono, H. (1989). Development to the late morula or blastocyst stage following in vitro maturation and fertilization of bovine Ocytes. Animal Reprod. Sc.18:139–148.

Fukui, Y. (1990). Effect of follicle cells on the acrosome reaction, fertilization and developmental competence of bovine oocytes matured in vitro. Molecular Reprod. and Devel. 26: 40–46.

Gordon, I. & Lu, K.H. (1990). Production of embryos in vitro and its impact on livestock production. Theriogenelogy 33: 77–87.

Hanada, A. & Nagase, H. (1981). Effects of sperm preincubation in rabbit uterus and of imidazole on the penetration of zona–free hamster eggs by bull and board spermatozoa in vitro. J. Anim. Reprod. 25:113–118.

Handrow, R.R., Lenz, R.W. &Ax, R.L. (1982). Structural comparisons among glycosaminoglycans to promote an acrosome reaction in bovine spermatozoa. Biochem. Biophys. Res. Comm. 107:1326–1332.

Handrow, R.R., Boehm, S.K., Lenz, R.W., Robinson, J.A. & Ax, R.L. (1984). Specific binding of the glycosaminoglycans Heparin to bovine, monkey and rabbit spermatozoa in vitro. J. Androl. 5: 51–63.

Kopt, G.S. (1990).The zona pellucida–induced acrosome reaction: a model for sperm signal traduction. En: Fertilization in mammals. Serono Symposia, U.S.A. Bavister, B.D., Cummings, J. & Roldan, E.R. (eds), pp. 253–266.

Langlais, J. & Roberts, K. (1985). A molecular membrane model of sperm capacitation and the acrosome reaction of mammalian spermatozoa. Gamete Res. 21: 183–224.

Lee, C.N. & Ax, R. L. (1984). Concentrations and composition of glycosaminoglycans in the female bovine reproductive tract. J. Dairy Sci. 67: 2006.

Lenz, R.W., Ax, R. I., Grimek, H.I. & First, N. L. (1982). Proteoglycan from bovine follicular fluid stimulates an acrosome reaction in bovine spermatozoa. Biochem. Biophys. Res. Commun. 106:1692.

Lenz, R.W., Ball, G.D., Lohse, J.K., First, N.L. & Ax, R.L. (1983). Chondroitin sulfate facilitates and acrosome reaction in bovine spermatozoa as evidenced by light microscopy, electron microscopy and in vitro fertilization. Biol. Reprod. 28: 683–690.

Lu, K.L. & Gordon, I. (1988). Effect of heparin on the capacitation of frozen–thawed bovine spermatozoa in the in vitro fertilization (IVF) of oocytes matured in vitro. 11th. Intern. Congress Anim. Reprod. and LA. Dublin, Ireland 26–30: 339.

Morrow, D.A. (ed) (1986). Current Therapy In theriogenelogy 2° ed. W.B. Saunders co. Philadelphia 1143 p.

Niwa, K.Y. ; Oghoda, O. (1988). Synergistic effect of caffeine and heparin on in vitro fertilization of cattle oocytes matured in culture. Theriogenelogy 30: 733–741.

O'Rand, M.G. & Fisher, S.J. (1987). Localization of zona pellucida binding sites on rabbit spermatozoa and induction of the acrosome reaction by solubilized zonae. Dev. Biol.119: 551–559.

Parrish, J.J., Susko–Parrish, J.L., Winer, A. & First, N.L. (1985). Effect of heparin and condroitin sulfate on the acrosome reaction and fertility of bovine sperm in vitro. Theriogenelogy 24: 537–549.

Parrish, J.J., Susko–Parrish, J.L., Winer, A. & First, N.L. (1988). Capacitation of bovine sperm by heparin. Biol. Reprod. 38: 1171–1180.

Roldan, E. & Harrison, R. (1990). Molecular mechanism leading to exocytosis during the sperm acrosome reaction. En: Fertilization in mammals. Serono Symposia, U.S.A. Bavister, B.D., Cummins, J. & Roldan, E.R. (eds), pp. 179–195.

Saling, P.M., Bunch, D., Le Guen, P. & Leyton, L. (1990). ZP3 induced acrosomal exocytosis: a new model for triggering. En: Fertilization in mammals. Serono Symposya, U.S.A. Bavister, B.D. Cummins, J. & Roldan, E.R. (eds.) pp. 239–252.

Uguz, C., Susko–Parrish, J.L. & Parrish, J.J. (1992). Cyclic adenosine monophosphate (cAMP) is elevated during capacitation of bovine sperm by heparin a oviduct fluid. Theriogenelogy 37: 311.

Uto, N., Yoshimatzu, N., Lopata, A. & Yanagimachi, R. (1989). Zona–induced acrosome reaction of hamster spermatozoa. J. Exp. Zool. 248: 113–120.

Yanagimachi, R. & Sui, N. (1974). Calcium dependence of the acrosome reaction and activattion of ginea pig spermatozoa. Exp. Celi Res. 89: 161–174.

Yanagimachi, R. (1988). Mammalian Fertilization. En: The Physiology of Reproduction E. Knobil y J.D. Neilly (ed) 1: 135–185.

Yanagimachi, R. (1989). Sperm capacitation and gamete interaction. J. Reprod. Fertil. 38 (suppl.) 27–33.